2结果与分析

2.1 Protamex酶水解对玉米谷蛋白泡沫性质的影响

由图1可知，经Protamex酶水解的玉米谷蛋白的起泡性和泡沫稳定性均显著高于原玉米谷蛋白（起泡性（124.46±3.85）%、泡沫稳定性（102.96±3.51）%，P＜0.05），且随着水解时间延长，呈先增加后减小的变化趋势。在水解120 min时，水解物的起泡性和泡沫稳定性都为最高，即（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，分别是原玉米谷蛋白的2.8倍和2.2倍左右。Patino和Ren等水解向日葵蛋白分离物时得到了相似的结果，水解可以提高蛋白质的起泡力和泡沫稳定性，但过度水解对其起泡性和泡沫稳定性产生了不利影响。

图1水解时间对玉米谷蛋白起泡性及泡沫稳定性的影响

小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图2a、b分别为玉米谷蛋白及其水解物经搅打产生泡沫的宏观和微观图像。玉米谷蛋白分散液中悬浮有明显的大颗粒，产生的泡沫量少且稀疏、形状不规则，随放置时间的延长泡沫几乎消失。微观形貌显示玉米谷蛋白膜在泡沫形成10 min时已经发生崩塌。玉米谷蛋白经过Protamex酶水解后，其水解物的溶解性显著增加（P＜0.05）（表1），因此在泡沫中未见明显颗粒，泡沫量明显增加且较为绵密，微观形貌显示气泡数量增多、近似圆形且大小趋于一致、平均气泡面积变小，分布致密有序。水解120 min样品所形成的泡沫最细小均匀，且在泡沫形成后的30 min内，与其他水解时间的样品相比，其气泡数量最多，平均气泡面积最小，蛋白膜的厚度较厚。有报道称平均气泡面积越小，分布越均匀致密越有利于其稳定。但随着酶解时间的延长，水解物的起泡性和泡沫稳定性都显著降低（P＜0.05）。蛋白质的起泡性与蛋白质溶解性、分子尺寸、疏水性和分子柔性等性质有关，泡沫稳定性则由蛋白质的黏度、膜的厚度、分子间相互作用等性质决定。因此，通过对以上性质的研究解析水解后玉米谷蛋白起泡性和泡沫稳定性的变化原因。

表1水解时间对玉米谷蛋白溶解性、水解度、表面张力和表面疏水性的影响

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

图2不同水解时间玉米谷蛋白泡沫的宏观图像（a）和微观图像（b）

2.2 Protamex酶水解对玉米谷蛋白溶解性和表面张力的影响

由表1可知，原玉米谷蛋白的溶解性仅为（20.90±0.17）%，经Protamex酶水解后，水解物的溶解性显著提高，在水解60 min后均可达到90%以上。这说明Protamex酶水解能够改善谷蛋白的溶解性，其水解物中蛋白质/多肽能够更好地分散在水中，形成胶体态溶液。研究过程中发现水解物分散液并非透明澄清的溶液，而是可以看到少量胶体物质悬浮于溶液中，并且在溶解性测定方法的离心力下，这些悬浮的蛋白质也不能够完全被沉淀，而是较稳定的存在于上清液中。当蛋白质溶液被搅打时，只有分散在溶液中的蛋白质才能够快速在气/水界面吸附。因此，水解物溶解性的提高使可以吸附到气/水界面上的蛋白质含量增加，这对玉米谷蛋白起泡力的改善具有积极意义。随着水解时间的延长，玉米谷蛋白的水解度在反应前30 min中快速增加，之后持续升高并在120 min后趋于平稳，所有水解物的蛋白质含量在74%～85%之间。原玉米谷蛋白的表面张力为（71.83±0.50）mN/m，经Protamex酶水解后，其水解物的表面张力均显著降低，且随水解时间的延长呈先降低后升高趋势。当水解时间在120 min时表面张力达最低（60.40±0.72）mN/m，这与其起泡性的变化趋势一致。这是由于适度的水解有利于增强蛋白质的分子柔性，暴露出更多疏水基团，更有利于水解物中蛋白质/多肽的疏水性基团和亲水性基团分别伸展至气相和水相，从而在界面处发生吸附，导致表面张力的降低。表面张力反映蛋白质分子在气/水界面的吸附和展开的速度。表面张力越低，蛋白能够越快速的完成在气水界面上的吸附，形成有一定黏弹性的保护层，促进泡沫的形成以及维持泡沫体系的稳定。过度的水解使蛋白质分子持续减小，低分子质量多肽由于肽段过短而失去分子柔性，不能在界面处发生吸附，导致水解时间为150 min水解物的表面张力增加。

2.3 Protamex酶水解对玉米谷蛋白粒径分布及Zeta电位的影响

蛋白质受到酶和热的作用，使得蛋白质分子发生解离和聚集的动态变化，通过测量粒径及Zeta电位可对其水解过程中蛋白质分子大小、聚集和静电相互作用情况进行表征。由图3a可知，玉米谷蛋白的粒径分布图中出现3个明显粒径峰，P1（＜68 nm）、P2（68～825、900 nm）和P3（＞3 000 nm）。随着Protamex酶水解时间的延长，水解物的粒径逐渐向小粒径方向移动，其中P2峰逐渐向左移动与P1峰重合，在水解60 min后的酶解物中P1峰完全消失，同时粒径较大的P3峰也在水解60 min后消失。这说明着Protamex酶水解作用不仅使玉米谷蛋白的粒径降低，同时使粒径均一度增加。由图3b可知，水解30 min后酶解物平均粒径显著降低（P＜0.05），并随着水解时间延长而持续降低。这可能是由于水解作用切断了玉米谷蛋白分子内肽键，大分子质量聚集体发生降解，低分子质量二聚体/亚基或者多肽逐步释放，使粒径降低。而水解反应过程中水热环境的作用可能引起暴露巯基的氧化交联等共价作用使部分蛋白质/多肽发生聚集，因此水解60 min和120 min样品的平均粒径差异不显著（P＞0.05）。杨晓钒等在酶水解处理扁桃仁蛋白质的研究中也发现了水解时间超过60 min后，水解物的粒径反而逐渐增大。值得注意的是，本研究采用马尔文纳米激光粒度仪测定的样品粒径为纳米级别，对玉米谷蛋白中部分粒径较大的大分子质量天然聚集体未能测出。

图3水解时间对玉米谷蛋白的粒径分布（a）和平均粒径及Zeta电位（b）的影响

由图3b可以看出，与原谷蛋白相比，Protamex酶水解物的Zeta电位绝对值显著降低（P＜0.05），在水解120 min时达到最低，为（16.30±0.50）mV，而酶解150 min时回升至（19.47±0.31）mV。玉米谷蛋白的Zeta电位为负值，说明其分子表面带有负电荷，绝对值降低说明了水解蛋白质分子表面净电荷减少。这是由于水解过程中脱氨基作用和带正电荷氨基酸暴露，使得蛋白质/多肽所带正电荷增加，从而中和部分负电荷所致。当水解时间延长至150 min，可能是由于反应进程中蛋白质/多肽的解聚与聚集动态变化导致部分带正电荷氨基酸重新被包埋而使绝对值增加，也可能是带负电荷氨基酸暴露增加所致。表面净电荷的减少对蛋白质/多肽在膜界面的吸附和扩散有利，促进泡沫的形成。同时还能够降低它们在界面的静电斥力，有利于形成黏弹性较好的界面膜而增强泡沫稳定性。Xiong Wenfei等研究也指出较小的粒径与表面电荷可加速蛋白质分子的扩散速度，提升其在气/水界面的吸附速率，并有利于蛋白质分子在界面上的展开和重排，从而提高起泡性。

2.4 Protamex酶水解对玉米谷蛋白内源荧光光谱的影响

玉米谷蛋白中的芳香族氨基酸，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基在激发波长290 nm处可产生荧光，即内源性荧光。内源荧光光谱变化反映了谷蛋白及其水解物中芳香族氨基酸所处的微环境极性的变化情况，是对Protamex酶水解过程中蛋白质三级结构变化的表征。由图4可知，与原玉米谷蛋白相比，Protamex酶水解物的内源性荧光光谱峰位发生明显的红移现象，且内源性荧光强度水解时间的延长而显著增强。这表明水解使玉米谷蛋白的芳香族氨基酸特别是色氨酸的极性环境增强，蛋白质结构伸展。Zheng Zhaojun等通过Bromelain和Alcalase分别水解黑豆蛋白时也获得了相似结果，水解产物的荧光强度均高于原蛋白样品。Protamex属于丝氨酸蛋白酶，酶水解过程中以丝氨酸残基作为活性中心主要促使玉米谷蛋白中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸等的羧基端多肽链裂解，导致芳香族氨基酸残基和疏水性氨基酸的暴露，增强了玉米谷蛋白的分子柔性，这有利于玉米谷蛋白质能发挥良好的起泡力和泡沫稳定性。但是在水解150 min尽管有更多的芳香族氨基酸残基暴露，却不能使水解物的起泡力和泡沫稳定性持续增加，这是因为影响玉米谷蛋白水解物起泡性质变化是多种因素相互作用的结果。

图4水解时间对玉米谷蛋白内源荧光强度的影响